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極東製薬工業(株)公式ブログです。
当社と関わりのある先生方からの投稿記事や、当社の細胞培養オタク研究員のつぶやきを紹介致します。

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【特別講義 第9回】なぜT細胞だけが胸腺で分化するのか

今回は、第2回, 第8回を担当いただいた順天堂大学の垣生園子先生より「なぜT細胞だけが胸腺で分化するのか?」というテーマでご寄稿いただきました。
免疫細胞の中でもT細胞だけが“胸腺”で成熟する謎の解明には、細胞培養技術の進歩も重要な要素だったようです。非常に興味深いテーマとなっておりますので、ぜひお楽しみください。

■ 講師紹介ページ:順天堂大学 垣生園子 先生


“なぜT細胞だけが胸腺で分化するのか?”
順天堂大学医学部 アトピー疾患研究センター 客員教授
垣生園子 先生


 免疫反応の司令塔と言われるT細胞は、他の免疫系細胞と違って骨髄では発生・分化せず、骨髄と離れた遠隔地の胸腔内ある胸腺という臓器内で誕生する。<細胞培養 特別講義2>で触れたように、ヌードマウスやディージョージ症候群のよう胸腺が欠如している個体ではT細胞が生体内に存在しない。なぜ、他の免疫細胞と異なった臓器でT細胞は分化するのか?そこで分化することがT細胞機能にどのような影響を及ぼすのか?約50年の長きに渡って謎であった。

 個体発生学的及び解剖学的に、胸腺の微小環境(ニッチ)は骨髄とは異なっていることが1960年代には既に解っていた。ニッチの違いとして多くの研究者が注目したのは、骨髄の骨格を作っているのは間葉系細胞であるのに対し、胸腺のそれは上皮由来の細胞であるという点にあった。一般に上皮系細胞は様々な物質を分泌・産生すると考えられていたので、胸腺上皮細胞もT細胞分化を誘導する因子を発現しているに違いないと想定された。実際、胸腺ホルモンという言葉が、研究論文にもよく見かけられた。

 培養液の改良による細胞培養技術の進歩に伴い、1980年代にはニッチ特異的分子探しへの挑戦が始まった。それにはまず、胸腺から上皮細胞を純粋に採取して培養することが求められた。しかし、遊離している免疫系細胞と違って、リンパ球を除去した胸腺上皮細胞の培養や細胞株の樹立及びその機能解析は困難を極め、胸腺上皮細特異的分子の研究はことごとく失敗に終わった。その主たる原因は、培養液ではなく胸腺上皮細胞特有の胸腺の臓器構成にあった。胸腺上皮細胞は腸管上皮のように基底膜上に整列しているわけではなく、リンパ球を取り囲む網籠のような立体構造を作っている。胸腺上皮細胞は単離・培養する過程でバラバラになり培養皿の底に一層にへばりつく状態となる。その結果、我々が後に発見した胸腺上皮特異的分子が失われてしまっていたのである。

 胸腺臓器培養の開発:胸腺上皮細胞培養に成功しなかった頃、胸腺内でのT細胞分化を追跡するために考案されたのが、胎仔胸腺を用いた臓器培養系である(Fetal thymic organ culture, FTOC)。あるいは単離した上皮細胞と未熟リンパ球を混ぜて軽く遠心して緩やかな立体構造を作り、filter上に乗せて培養する方法(re-aggregation thymic organ culture, RTOC)で、骨髄から移入したばかりの“あすなろ”T細胞が、どのように胸腺構築中で分化するかを、種々の遺伝子やタンパク質の発現を指標にして経時的に解析した。その結果、胸腺内でのTリンパ球自身の分化に関する沢山の情報を得た。興味深いことに、この方法はいずれも英国で開発された。まさに、私が留学していた時のことである。

 胸腺上皮細胞に特異的なT細胞分化に関わる分子の発見は、上皮細胞の培養系の研究からでなく、遺伝子欠損実験を駆使した造血幹細胞の分化におけるNotch分子の役割解析から生まれた。すなわちNotch欠損マウスでは、T細胞のみが分化できなかった。T細胞が分化しないヌードマウスでは、胸腺上皮が適正に分化しないことが原因である。それでは、Notchにシグナルを入れるリガンドが胸腺ニッチに発現しているのではないか?と考えた。そこで、Notch リガンドを欠如するマウスを作成すると、見事にT細胞は欠如していた。

 胸腺ニッチの研究の歴史は、iPS細胞等からin vitroで分化させた細胞から組織構築に挑戦する上でも参考になるかもしれない。最近の培養技術は、in vitroで立体構造を保つ方法の開発が進んでいる。




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3製品の技術情報ページを更新しました!

下記3製品の技術情報ページを更新いたしました。

各製品ともに新しい実施例やプロトコルをご覧いただけるようになりました。CP-5Eにつきましては、2016年11月に開催された日本動物細胞工学会において発表したポスターも掲載しております。

■ ヒトiPS/ES細胞用培地
Stem-Partner Human iPS/ES cells medium 技術情報ページへ


■ 凍結保存液
CP-5E技術情報ページへ


■ 細胞分散液
Pronase/EDTA for Stem技術情報ページへ






今後も新しい情報を取得しましたら、随時アップデートする予定ですので、ご意見やご要望がございましたらお気軽にご連絡くださいませ。

こちらの記事に関するお問合せはこちら
メールピンク cellculture@kyokutoseiyaku.co.jp

【特別講義8】免疫反応の制御と制御制T細胞

私達のからだを守るために重要な免疫反応ですが、病原体などの異物を退治した後も全力で働いてしまうと、自分自身を傷つけてしまうことがあります。そこで、今回の特別講義は順天堂大学の垣生先生より「免疫反応の抑制と制御性T細胞」というテーマでご寄稿いただきました。ぜひお楽しみください。

■ 講師紹介ページ:順天堂大学 垣生園子 先生


“免疫反応の抑制と制御性T細胞”
順天堂大学医学部 アトピー疾患研究センター 客員教授
垣生園子 先生

 
 前回は、T細胞は抗原刺激を受けると活性化され、多彩な機能を発揮して生体防御に貢献すべく免疫反応をリードすることを述べた。しかし、免疫反応は活性化されっぱなしでは生体が破綻するので、刺激後にその活性化状態を終焉させて、新たな抗原に向けての臨戦体制を準備しなければならない。そこには何らかの抑制機構が必要であるが、闇雲に免疫反応を低下させたのでは、生体防御としての免疫機能は失われる。特定の抗原に対して惹起される特異的免疫反応のみを抑制することが望まれる。抗原特異性をもつT細胞がその役割を担っていることが古くから提唱されてきたが、その実態は今世紀になってやっと見えてきた。

 免疫反応を抑制するT細胞サブセットは、サプレッサー、抑制性T細胞あるいは制御性T細胞等とよばれているが、最近の傾向は制御性T細胞(レギュラトリーT細胞、Treg)が一般的呼称となりつつある。尤も、制御とは抑制のみならず活性化も含むとの観点から、抑制性T細胞が好ましいとの意見もある。制御性T細胞には、エフェクターT細胞と識別できる細胞表面マーカーやFoxp3に代表される転写因子が見いだされ、同T細胞の機能解析に大きく貢献している。例えば、CD4+CD25+Foxp3+T細胞は代表的制御性T細胞として市民権を得ており、同細胞のみを欠如させると自己免疫疾患様症状が出現することが示され、制御性T細胞は自己成分に反応するT細胞の活性化を抑制していることが明らかにされた。また、外来抗原刺激が常時活発である腸管粘膜には、高い頻度で制御性T細胞が同定されており、過剰な免疫反応の活性化抑制に働いていることの傍証になっている。

 現在は、制御性T細胞がいかにしてエフェクター細胞機能を抑制するか、を解明する段階に入っている。しかし、制御性T細胞が免疫反応を抑制する機序を詳細に解析するためにも、より深く理解するためにも、いくつかの留意点が浮かび上がってきている。まず、制御性T細胞に特徴的マーカーが見いだされてはいるが、それらは抑制機能をもつT細胞全てに共通しているわけではない。例えば、CD4+CD25+Foxp3-T細胞も、CD4+CD25-Foxp3-LAG3+T細胞も抑制機能をもつとの報告がある。それらは、分化過程や誘導方法が多様であるが、免疫反応を抑制するT細胞サブセットとして括られているのが現状である。また、抑制方法に関しても、制御性T細胞自身が抗原刺激を受けたエフェクター細胞の活性化に直接負のシグナルをいれるというよりは、むしろ、抗原認識をしたT細胞が活性化するために必要な正の補助シグナルを制御性T細胞が阻止する、とするシナリオが比較的広く受け入れられている。(注:T細胞はT細胞受容体(TCR)を介したシグナルのみでは活性化されず、T細上のCD28分子が抗原提示細胞(DC)上のリガンドCD80/86と結合することによってT細胞に第2のシグナルを導入することが必要である。制御性T細胞はCD28と競合するCDLA-4のような補助分子を高く発現しており、CD80/86と強い結合をすることによって、エフェクターT細胞上のCD28との結合を阻止できる。) 以上の点を踏まえた上で、今後は、いかにして制御性T細胞が免疫反応を抑制するかの機序解明に望むべきであろう。

 免疫寛容という現象が知られている。特定の抗原に対して惹起された特異的免疫反応が抑制される状態を指す。自己成分に対しては免疫反応が惹起されない生理現象がその代表格である。一方、非生理的ではあるが、非自己である組織を移植する場合、レシピエントにおける対移植片に対する免疫寛容が成立しなければ、移植片は生着しない。いずれの寛容状態をいじするためにも、T細胞の標的である自己成分あるいは移植片は生涯生体内に存在するので、免疫寛容状態維持のためには、反応性エフェクターT細胞は継続的に分化し続けるか、あるいはエフェクターメモリーT細胞のように長期寿命をもって生体内で生存し続ける必要がある。制御性T細胞の分化・機序検討の必要性が、ここにも存在する。
 



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【主席研究員部屋7】 水は培地の生命です

「水は培地の生命です」

最近は大型台風なども含めて記録に残るほど水害が頻発しており、被害に遭われた方はご苦労をされているのだろうと心を痛めています。台風ではないのですが、去年は私達の研究所のある茨城地方も集中豪雨に襲われました。最初はまあ大丈夫だろうと気楽に構えて車で帰宅したのですが、道路はすでにかなり冠水しており、自宅に帰り着くのにほんとうに苦労しました。水をなめたためとひどい目に遭ってしまったんです。

水は御存知の通り、生命を維持するためには欠くべからざる物質です。成人では体重の50〜60%を占めますし、食事がなくても人は2〜3週間生きていくことが可能ですが(個人的には全く自信がありません…、1日分3食も抜いたら生きてゆく気力が無くなりそうです。)、水なしだと数日が限界だと言われています。

そこで今回は培地の成分の中でも99〜98%と最も高い重量の比率を占め、かつ培地、特に無血清培地の性能に大きな影響を与える重要な成分、「水」の話をします。水はとても大事なんですよという話です。

培地の調製に使われる水についてですが、精製度の低い水は培地の水には向きません。特に無血清培地では水の精製度が性能に影響します。血清を添加した培地の場合、精製度の低い水でもあまり性能差は出ないのですが(だからといって水道水は使えません)、無血清培地にした場合、精製度の低い水を使うと増殖率が低下したりします。血清蛋白質には毒性の中和効果があることが知られていますが、逆に言えば、この様な蛋白質が含まれない培地、例えば無血清培地では水の精製度がとても重要なのです。そのため、培地用として精製水の調製法を複数準備しており、用途や目的によって使い分けています。

水の良し悪しが培地の性能を左右する。水は培地の生命なんですよ。

私の学生時代(30うん年前ですねえ)にはイオン交換水を2回蒸留した再蒸留水を使っていました。再蒸留水の製造は学生にとってかなりの手間で、20kg以上の重いイオン交換水のタンクを棚の上に上げて少し栓を開き、ゆっくりヒーターを組み込んだガラス製の蒸留装置に流し込んで、まず一回蒸留する。その後、蒸留した水をもう一度棚に持ち上げて蒸留装置に繋いだ後に、再度蒸留するという作業でした。特に蒸留水が溜まったタンクを頻繁に上げたり下げたりする必要があるというのも問題の一つでした。それだけではなく、二回も蒸留するので、時間当りに採水できる量はあまり多くないということも問題でした。現在では再蒸留法を用いないでも純度の高い精製水が大量に作れる装置が販売されており、そのような問題は無くなくなっています。

私達が学生時代に使っていたガラス製の蒸留水製造装置は逆さにしたクラゲかタコに形が似ていたので、仲間内で逆さ火星人と呼ばれていましたが、現在ではこの様な蒸留水製造装置はあまり見かけなくなっており、少し寂しい気分ではあります。と言っても、今更学生時代のような重労働をしたいのかと聞かれれば、嫌だとは言いそうですが。もっとも、社内(と家内...)から少しは運動したらと言う声が聞こえていますが、できるだけ聞こえないふりをしています。

さて、一般的には超純水と呼ばれる精製水が培地調製に使われることが多いです。超純水は日本薬局方の規格「医薬品等の試験に用いる水」(第十七改正日本薬局方 P2459 G8)、米国試験材料協会のバイオメディカルグレード(ASTM D 5196-06)、用水・排水の試験に用いる水のA4以上(JIS K 0557:1998)等の規格がほぼ該当します。おおまかには比抵抗値(電気抵抗率)が18MΩ・cm以上、更には全有機炭素(TOC、Total Organic Carbon)が50 ppb以下の状態まで精製された精製水を指しています。精製度の高い水はハングリーウォーターとも呼ばれており、容器の残留物や空気中の塵などを取り込んであっという間に規格値から外れてしまうんです。以前確認したところ、採取時はTOCが数ppbだったのですが、容器に入れて1時間程度放置していたら10倍以上に跳ね上がっていました。精製水は採取してから出来るだけ早く使わないとだめなんですよね。

最後に水にかかわる古傷の昔話なんぞを少し…
ある朝、私についていた学部学生が青い顔をして夜中に逆さ火星人が大爆発したと言うのです。びっくりして何があったのか尋ねた処、深夜に蒸留水製造装置が破裂して、辺り一面ひどいことになったとのこと。手を抜きたがったその学生が流れ込むイオン交換水の量を加減し、ヒーター温度を下げれば一晩放置しても良いだろうと考えたことが破裂した原因でした。

何が起こったかというと、採取していた再蒸留水が液体瓶の上部まで溜まりきったために、蒸留水取り出し口が液面で塞がれたこと。そこに供給側のイオン交換水が空になったため、流入弁が閉じた状態でヒーターが停止したこと。そのため、加熱している蒸留槽内に冷えた蒸留水が急激に逆流した結果、ガラス製の蒸留槽が破裂したようでした。割れた破片の一部は私の使っていた古い実験机に刺さっているという恐ろしい状況でした。もしその時にそこにいたらと考えると冷や汗が止まりません。その後、私とその迂闊な学生がまとめて教授にたっぷり、それはもうたっぷりと説教されたことは良い思い出(?)となっています。

水をなめると本当にひどい目に遭います…



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Medical Science Digest に掲載されました

皆様、新年明けましておめでとうございます。
本年もご期待に添えるよう社員一同尽力してまいりますので、どうぞよろしくお願い申し上げます。

さて、本日は弊社のヒトiPS/ES細胞用製品の開発への取り組みについて、下記雑誌に掲載されましたのでご案内させていただきます。




Medical Science Digest(Vol. 43 No1 2017 1月号)P.50〜
「iPS/ES細胞の安定的な培養のために」極東製薬工業(株)



本雑誌の今回の特集テーマは「臓器の再生に向けて」という題で、横浜市立大学の谷口英樹 教授がまとめられております。その他にも興味深いお話ばかりですので、ぜひ弊社のIndustry News欄と合わせてご覧いただければと思います。

今後も新しい情報をご提供させていただきますので、ご意見ご要望がございましたらお気軽にご連絡ください。

こちらの記事に関するお問合わせはこちら
メールピンク cellculture@kyokutoseiyaku.co.jp

日本動物細胞工学会でポスター発表いたしました!

11月9〜12日に神戸国際会議場で開催されました日本動物細胞工学会にて3演題のポスター発表をいたしました。本大会は国際大会と同時開催でしたので、ポスターも英語で準備いたしました。

【P-3】
Development of Culture Medium for Transient Transfection of Mammalian Cells by Analytical Approach

【P-6】
Cryopreservation of Antibody-producing Cell Lines with Serum-free Cryoprotectant Reagent CP-5E

【P-12】
Development of the Serum-Free Medium for Culture of CHO Cells


現在開発中の「動物細胞用 一過性トランスフェクション用培地」と「CHO細胞用培地」についての研究成果や、現在販売しております「凍結保存液 CP-5E」のアプリケーションデータを発表させていただきました。たくさんの方に当社ブースにお越しいただき、誠にありがとうございました。この場を借り厚く御礼申し上げます。



来年も展示会や学会にて出展予定でおりますので、皆様とお会い出来ることを楽しみにしております。



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【特別講義7】 心の動きと免疫

 新聞やテレビなどで「病は気から」という言葉を目にすることがありますが、今回の特別講義では、「心の動きと免疫機能の関係」について順天堂大学の奥村先生よりご寄稿いただきました。
 第5,6回の主役でありましたNK細胞が、私達の心の動きによって影響を受けるという興味深いトピックスをご提供いただきました。今回もどうぞお楽しみください。

■ 講師紹介ページ:順天堂大学 奥村康先生





“心の動きと免疫”
奥村 康 先生
順天堂大学アトピー疾患研究センター長



 心の動きが体に大きく影響を与える事実は、昔から沢山知られております。しかしその詳しい仕組みはほとんど判っておりません。癌の末期を宣告された方でもフランスのルルドの泉に願をかけに行くと1億人のうち何十名か助かるということも知られております。鍼もお灸も百人が百人効くはずなく、効くのは何十人に一人ですがその一人のために3000年以上も昔より受け継がれ今に至っております。

 昔、朝日新聞に載った“フィンランド症候群”という一種の臨床実験が参考になります。フィンランドの健康寿命を長くする事を目的に、健康管理の重要性を国民に知らせるべく行われた臨床実験です。40歳から45歳の男性を職業、家庭環境等を大体統一し600名ずつで2つのグループに分けます。一方のグループは徹底的に厳しく健康管理に介入し、タバコ、酒はもちろん控えさせ毎年2度はドッグで体を調べるといった健康維持に介入された人達です。もうひとつのグループはその逆で、酒もタバコも無制限、定期的な健康検査もなし、といった自由な人達です。15年フォローして死亡した方の多かったのは意に反して圧倒的に健康維持に介入したグループだったのです。

その頃の推察ですがコレステロール、中性脂肪を低く管理したことが是か非か、またタバコも酒も絶つといったストイックな生活を強いたためストレスが溜ってきっと免疫が落ちたのではないか。というようなことが話題になりました。今となりますとその2つともそんなに的外れな考察ではないということです。コレステロール、中性脂肪を低くしても長生き出来るというきちんとしたデータはないようです。今のデータから言えるのはある程度高くないと長生きできないことです。不思議に低い方は発癌率や感染症になる確率が高いのです。薬で下げますと“鬱”になることも判っています。健康介入群の中の死亡者の中には自殺が何例か含まれてます。コレステロールも中性脂肪も体にとって極めて大切なもので強い血管や免疫を高く保つのに役立ってます。

 私のひとつの専門分野にNatural Killer細胞の働きの研究があります。前回にも書きましたが、私は米国より帰国後このNatural Killer(NK)細胞を同定するのに成功し、加えてNKの無い動物をつくることが出来ました。その動物は発癌率がやたらと高いのとウィルスに極めて弱くバタバタと死ぬのです。NKの重要性は、その後のヒトでも解明されNKさえ高くしておけば長生きで癌にならず感染にも強いことが分かりました。ですから長生きの方はNKが強く弱い人は早死にするのです。このNKは面白いことに心の動きの影響を強く受けるのです。少しでも淋しいような受動的なストレスで低くなってしまいます。例えば、若い方はNKは強いのですが学校の試験のようなストレスで下がります。ですから風邪を引くのは大体試験の時です。

 もっと激しい悲しい実験的なストレスは、子育てをしてる親から子を取り上げた時です。NKは急に下がって上がってきません。心の動きを一番反映するのがNKで、ある程度定量することも出来、数値で表せますから皆様の興味を引いてます。逆に笑うだけでNKは見事に上がります。楽しい友人、家族と笑いの絶えない方達が一番NKが高いのです。今世紀の心の医学のトピックスのひとつはこのNKの研究かもしれません。



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